Важнейшие результаты

Тема ИБК РАН

«Роль рецепторных и каналообразующих белков, нейромедиаторов и низкомолекулярных регуляторов, в том числе внутриклеточного кальция, в трансдукции сигнала и функционировании нервных клеток, клеток периферических вкусовых органов, адипоцитов, иммунных и мезенхимальных стволовых клеток».

Результаты

• В ходе поиска соединений, активных в отношении альфа7-подобных никотиновых холинорецепторов (нХР) и потенциал-активируемых кальциевых каналов, найдены сильно действующие на нХР полипептиды: один в яде африканской гадюки Bitis arietans и два в яде степной гадюки Vipera ursinii renardi (семейство Viperidae). Белок из яда B. arietans очищен и получил название «битанарин», частично исследована его структура, обнаружена фосфолипазная (ФЛА2) активность и способность конкурировать с альфа-бунгаротоксином за связывание с нХР мышечного типа в обогащенной мембранной фракции электрического органа ската Torpedo californica, с альфа7 нХР человека, экспрессированными в клетках линии GH4C1 и с ацетилхолин связывающим белком из ганглиев моллюсков [Vulfius C.A. et al. 2011, Вульфиус. Е.А. и др. 2009, Вульфиус. Е.А. и др. 2011]. Была выдвинута гипотеза о том, что способность взаимодействовать с нХР является общим свойством ФЛА2 из ядов змей. Гипотеза подтверждена при исследовании действия семи ФЛА2 из ядов трех змей семейства Viperidae и двух змей из семейства Elapidae, получены количественные данные, характеризующие сродство ФЛА2 к нХР. Условия проведения испытаний и контрольные опыты свидетельствуют о том, что блокирующее действие ФЛА2 на нХР не обусловлено их фосфолипазной активностью [Vulfius C.A. et al. 2011, Гриневич А.А. и др. 2013, Vulfius et al. 2014]. Таким образом, впервые показано, что ФЛА2, содержание которых в ядах достигает высокого уровня, имеют две мишени поражающего действия: фосфолипиды мембраны и нХР.


• При помощи методов анализа нелинейной динамики (вейвлет-преобразование, БФА и быстрое Фурье-преобразоване) показано, что активность потенциало-зависимых K+-каналов (KV-каналов) нейронов Lymnaea stagnalis и KCa-каналов из почечных клеток Vero характеризуется фрактальным и мультифрактальным поведением кинетических параметров. При анализе записей активности одиночных ионных каналов, полученных пэтч-методом в нашей лаборатории, обнаружено, что влияние внешних физико-химических факторов не является первопричиной наличия корреляционных зависимостей в воротном процессе K+-каналов и их фрактальных свойств. Обнаруженные свойства являются фундаментальными и характеризуют активность данных каналов как нелинейный процесс. Построена модель работы воротного механизма ионного канала, основанная на броуновской динамике воротной частицы в потенциальном поле сил. Модель учитывает гидрофобные взаимодействия ионной поры с молекулами воды окружающего раствора и медленные конформационные изменения белковой глобулы канала во время его активности. В рамках модели показано, что гидрофобное взаимодействие ионной поры с молекулами воды является причиной, определяющей особенности кинетики ионных токов («пачечная» активность, долгоживущие закрытые состояния и полиэкспоненциальный вид распределений его кинетических параметров). Модель адекватно отражает фрактальные свойства, эффект долговременной «памяти» и другие особенности активности ионных каналов, которые были описаны в литературе переусложненными многокомпонентными модельными системами [Гриневич А.А., Асташев М.Е., 2010].


• Проверена выдвинутая нами гипотеза, согласно которой при активации высоко- и низкоаффинных рецепторов формилированных пептидов (FPR1 и FPR2, соответственно), участвующих в мобилизации нейтрофилов и их цитотоксических функциях, происходит дивергенция сигнала с инициацией традиционных и альтернативных сигнальных путей, в том числе, запускаемых через малые ГТФ-связывающие белки. Мы показали, что в нейтрофилах из очага острого воспаления белки Ras участвуют в активации NADPH оксидазы, ответственной за генерацию АФК. Активация белков Rac приводила к снижению ответа при стимуляции FPR1. Блокада белков Rho подавляла респираторный ответ, инициированный FPR1, так и FPR2, предположительно из-за невозможности реорганизации белков цитоскелета и сборки компонентов NADPH оксидазы [Филина Ю.В. и др. 2011]. При продолжении исследований на зрелых гранулоцитах костного мозга мыши обнаружена различная кинетика активации белка RhoA, опосредованной FPR1 и FPR2. Впервые показано, что RhoA является одним из регуляторных и сигнальных компонентов респираторного взрыва через FPRs в гранулоцитах. Связывание FPR1 и FPR2 соответствующих агонистов запускает активацию RhoA. Сигнализация FPR1 через RhoA и его мишень Rho-активируемую киназу (ROCK), увеличивает активность NADPH оксидазы. Но в случае FPR2 - RhoA/ROCK вместе с системами, зависимыми от цитоскелета, подавляют NADPH оксидазу. Предложенный механизм может ограничивать вызываемые АФК повреждения собственных тканей при хемотаксисе нейтрофилов [Filina J.V. et al. 2014].


• Выброс АТФ во внеклеточную среду является признаком массового разрушения клеток организма и сигналом тревоги для мобилизации клеток врожденного иммунитета в очаг повреждения или острого воспаления. В случае хронического воспалительного процесса способность организма сопротивляться инфекции снижается за счет инактивации рецептов P2X малыми постоянно присутствующими в среде концентрациями АТФ. Нами изучена молекулярная основа иммуностимулирующего действия кукумариозида голотурий А2-2 – природного иммуностимулирующего агента. На одиночных мононуклеарных клетках нами было показано, что кукумариозид А2-2 связывается с пуриновыми рецепторами Р2Х семейства 1-го и 4-го типа и модулирует их активность путем вывода рецепторов из инактивированного состояния. Это означает, что А2-2 увеличивает способность рецепторов отвечать на агонист (например, АТФ) на фоне АТФ в инактивирующих концентрациях, но сам агонистом не является. Обнаруженный нами механизм регуляции кукумариозидом А2-2 рецепторов Р2Х, вероятно, является основой иммуномодулирующего действия кукумариозида А2-2 [Пислягин Е.А.и др. 2012, Асташев М.Е. и др. 2013].

Тема ИБК РАН

«Изучение пероксиредоксинов и химерных рекомбинантных белков на их основе с целью создания нового класса антиоксидантных препаратов. Разработка подходов к созданию средств диагностики и коррекции патологических состояний, связанных с развитием нейродегенеративных процессов, гипоксии и другими системными нарушениями».

Результаты

Основные достижения по проблеме «Регуляция скорости кровотока в микрососудистом русле»

• Нами разработан оригинальный метод анализа осцилляций периферического кровотока, измеряемых с использованием лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ). Метод основан на использовании теории адаптивных вейвлетов для узкополосной фильтрации как стационарных, так и сильно нестационарных сигналов длительностью более 6 мин в диапазоне частот от 0,001 до 2 Гц. Преимущество нашего метода в том, что при его применении не происходит потери информации на "краях" сигнала, что принципиально важно для анализа сильно нестационарных сигналов типа "взрыв", при исследовании ЛДФ-грамм, ЭКГ, ЭЭГ, миограмм, а также сигналов в иных областях науки и техники [Tankanag A.V. et al. 2009, Tikhonova I.V. et al. 2010, Танканаг А.В. и др. 2009]. Метод позволил проанализировать такой сильно нестационарный процесс, как развитие реактивной постоклюзионной гиперемии в ответ на кратковременную ишемию у условно-здоровых участников разного возраста и у больных с бронхиальной астмой (БА). Мы впервые показали, что среднее статистическое снижение пределов регуляции микроциркуляторного русла (МЦР) по миогенному, нейрогенному и эндотелиальному пути начинается примерно в 40 лет, а наиболее выраженные изменения в функционировании артериолярного и венулярного звеньев МЦР в среднем наблюдаются в более позднем возрасте – после 70 лет [Tikhonova I.V. et al. 2013, Тихонова И.В. и др. 2010, Тихонова И.В. и др. 2013]. У больных БА не обнаружено достоверных изменений в системах миогенной и нейрогенной регуляции по сравнению со здоровыми участниками исследования, в то время как в частотном диапазоне эндотелиальной активности выявлено достоверное двукратное уменьшение амплитуд колебаний кровотока как в покое, так и в процессе развития постокклюзионной реактивной гиперемии, что может свидетельствовать о подавлении регуляции периферического кровотока по эндотелиальному пути (сосудодвигательная эндотелиальная недостаточность) [Тихонова И.В. и др. 2014].


• До последнего времени остается открытым вопрос о существовании связи между респираторной синусовой аритмией (РСА), наблюдаемой как вариабельность сердечного ритма, и колебаниями скорости кровотока в МЦР (КСКвМЦР). В условиях единого протокола была исследована зависимость амплитуд РСА и амплитуд КСКвМЦР от частоты дыхания (ЧД) и уровня симпато-вагального баланса у 29 молодых здоровых добровольцев. Исследования проводились в условиях дыхания, контролируемого по глубине и частоте от 0,03 до 0,25 Гц. Было подтверждено наличие колоколообразной зависимости РСА от ЧД с центральной частотой около 0,1 Гц. Обнаружено, что в областях кожной поверхности с высокой степенью иннервации (подушечки пальцев) зависимость амлитуд КСКвМЦР носит частотно зависимый характер и более выражена у испытуемых с преобладанием парасимпатического тонуса [Krasnikov G.V. et al. 2013, Красников Г.В. и др. 2014]. Для оценки степени участия центральных и местных механизмов в формировании амплитуды КСКвМЦР применен математический аппарат анализа фазовой вейвлет-когерентности с оценкой достоверности полученных значений по методу сравнения с набором суррогатов. Сравнивали между собой ЛДФ-граммы, одновременно регистрируемые с контрлатеральных участков кожи запястья правой и левой руки. По степени достоверной когерентности оценивали степень участия центральных механизмов в формировании КСКвМЦР. Обнаружено, что на частоте близкой к 0,1 Гц у всех испытуемых наблюдается достоверная дистальная когерентность. На частотах выше и ниже 0,1 Гц число испытуемых с достоверной когерентностью плавно уменьшается. Результат указывает на существование частотно-зависимых механизмов локального и центрального происхождения в регуляции кровотока [Tankanag A.V. et al. 2014]. Мы предполагаем, что наличие 0,1 Гц колебаний в сердечно-сосудистой системе (ССС) связано не только с особенностями процессов автономной регуляции, но, в первую очередь, со структурными и гидродинамическими свойствами самого сосудистого русла. С использованием гидродинамической модели ССС мы обнаружили ранее не известный системный механизм формирования 0,1 Гц компонента. Модель предсказывает, что возможно формирование амплитудного пика в районе частоты 0,1 Гц для зависимостей амплитуд колебаний давлений крови и ее объемных скоростей в различных сосудистых регионах от частоты сердечных сокращений и при отсутствии регуляции со стороны нервной системы. Наблюдается сильная зависимость величины амплитудного пика и его положения от эластичности сосудов и вязкости крови. В рамках нашей модели показан принципиально новый механизм формирования 0,1 Гц компонента. Он не является локальным, а формируется ССС как единым целым [Гриневич А.А. и др. 2014].